Haemophilus influenzae in coltura

 

Classicamente il terreno di coltura si intende come mezzo nel quale o sul quale può avvenire lo sviluppo e la crescita in vitro di un microrganismo. Ovviamente un terreno di coltura deve prevedere la giusta concentrazione di sostanze nutritive per la crescita batterica, un adeguato grado di umidità oltre che essere sterile e protetto da qualsiasi inquinamento

Contenuti dei terreni di coltura

Peptoni: si tratta di un insieme di composti idrosolubili, ottenuti per idrolisi (acida od enzimatica) delle proteine (caseina, soja, ecc.);

NaCl: aggiunto in concentrazioni adeguate per le necessità osmotiche richieste, in vivo, da microrganismi parassiti;

Zuccheri: glucosio, lattosio, mannite, sono aggiunti per scopi specifici in terreni particolari;

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Estratti: di lievito, carne, d’organo: forniscono fattori di crescita e sali inorganici;

Arricchimenti: sangue lisato, emoglobina, latte disidratato, gelatina o vitamine. Per la crescita di batteriesigenti” dal punto di vista nutrizionale;

Supplementi selettivi: specifici (antibiotici) od a spettro meno definito (sali biliari, cristalvioletto, sodio-azide)

Indicatori: le sostanze coloranti (fenolo, blu di bromo fenolo, rosso fenolo, verde di bromo cresolo, ecc.) permettono di seguire il metabolismo fermentativo del batterio esaminato, determinando viraggio di colore del terreno a valori critici di pH

Classificazione dei terreni di coltura

Stato fisico
  • LIQUIDI: componenti sciolti in acqua e sterilizzati.
  • SOLIDI: possono essere naturalmente
    tali (terreno alla patata) o vengono solidificati per aggiunta di un agente gelificante (agar, gelatina, silica-gel).
Costituzione chimica    
  • MINIMI: per la crescita dei soli batteri autotrofi. Gli elementi essenziali (N, C, S, P) sono presenti come sali inorganici in composizione e quantità note.
  • SINTETICI (Definiti): nota la formulazione chimica di ogni ingrediente; le singole sostanze di cui il batterio necessita sono presenti in quantità note.
  • COMPLESSI: ignota l’esatta composizione chimica delle sostanze nutritive (estratto di carne di bue, cuore, cervello, ecc.). Comprendono la maggior parte dei terreni usati in laboratorio.
Funzione
  • ARRICCHIMENTO (ELETTIVI): la specie microbica di interesse vi cresce in un tempo assai più breve rispetto ad altre specie microbiche.
  • SELETTIVI: contengono sostanze batteriostatiche (sali biliari, tellurito di K, NaCl, azide sodica, cetrimide, cristalvioletto) a concentrazione nota che inibiscono o rallentano lo sviluppo di molte specie microbiche. Utilizzati per isolare specifici microrganismi da campioni altamente contaminati.
  • DIFFERENZIALI: contengono sostanze indicatrici di particolari reazioni biochimiche che avvengono nel terreno stesso. Usati per la identificazione di specifici microrganismi.

Principali terreni di coltura

L’agar-agar (noto anche come agar, noto in Giappone col nome di kanten) è un polisaccaride usato come gelificante naturale e ricavato da alghe rosse appartenenti a diversi generi. Dal punto di vista chimico, è un polimero costituito principalmente da unità di D-galattosio (è quindi detto poligalattoside).
L’agar agar non può essere digerito dagli enzimi presenti nella maggior parte degli organismi, batteri e miceti compresi, per questo motivo è utilizzato in microbiologia per solidificare i terreni di coltura per tali microorganismi. L’agar agar nell’industria farmaceutica e dolciaria è usato come addensante. Il suo principale utilizzo in fitoterapia è legato all’effetto calmantedimagranteantinfiammatorio e protettivo che esso esercita a livello della mucosa gastrica e dell’intestino poiché ricopre con un sottile strato le mucose e le protegge dagli ulteriori danni dell’infiammazione. A dosaggi più elevati esso è efficacissimo come lassativo: per la proprietà di idratarsi, aumenta la massa fecale e si comporta da purgante meccanico, privo di effetti collaterali. L’agar agar è indicato pertanto in pediatria e in età avanzata.
Risulta quindi coadiuvante per la stipsi (azione meccanica), il colon irritabile, la diverticolite, la gastrite e come dimagrante.

  • Cetrimide Agar:Terreno selettivo per l’isolamento e l’identificazione presuntiva di Pseudomonas aeruginosa. Mg, cloruro e potassio solfato stimolano la produzione di pigmento. La Cetrimide, verso cui P. aeruginosa è resistente, inibisce la crescita di gran parte dei microrganismi.
  • Columbia Blood Agar Base:Terreno di uso generale e base per terreni addizionati di sangue (S. aureus, streptococchi emolitici) e selettivi (cocchi Gram+, H. pylori, Gardnerella).
  • Hektoen Enteric Agar:Terreno differenziale e selettivo per l’isolamento di Salmonella e Shigella dalle altre Enterobacteriaceae in campioni enterici. I sali biliari inibiscono la crescita della normale flora Gram+. Presenza di tiosolfato (fonte di S) e sali di ferro (citrato ammonio ferrico) per evidenziare la produzione di H2S (colonie nerastre, Salmonella).
  • MacConkey agar: evidenziazione, isolamento e conta dei coliformi e degli Enterobatteri (E. coli, Klebsiella, Salmonella, Shigella). La presenza di cristalvioletto e dei sali biliari inibisce la crescita di Gram+. La presenza di lattosio evidenzia la capacità Gram+ e la capacità fermentante: le colonie fermentanti il lattosio (Klebsiella, E. coli, Enterobacter aerogenes) appariranno rosa acceso, incolori quelle non fermentanti (Salmonella, Shigella, Proteus, Serratia, P. aeruginosa).
  • Wilkins-Chalgren Anaerobe Agar:non selettivo, per la crescita e test di sensibilità degli anaerobi.
  • Urea broth base (terreno di Christensen): evidenziazione attività ureasica delle Enterobacteriaceae mediante viraggio di un indicatore di pH (rosso fenolo).
  • Mannitol Salt Agar:Terreno selettivo per l’isolamento di stafilococchi presunti patogeni. S. aureus produce colonie con alone giallo-brillante; gli stafilococchi coagulasi-negativi formano colonie di colore rosso porpora.
  • Mueller-Hinton Agar:per la determinazione dei saggi di antibiotico-sensibilità.
  • Saboraud Dextrose Agar:terreno acido indicato per l’isolamento di diversi funghi e lieviti. Candida albicans(colonie incolori/rosa); Candida non-albicans(colonie rosa scuro/rosse).
  • Salmonella-Shigella Agar (Agar SS):terreno selettivo e differenziale per l’isolamento di Salmonella e Shigella dalle feci e da campioni di altra natura.

Crescita e Tolleranza

“Crescita” generalmente indica l’acquisizione di biomassa per la divisione cellulare (o riproduzione). Alcuni microrganismi possono sopravvivere a condizioni non permissive per la loro crescita. Il suffisso “-fili” viene spesso usato per descrivere le condizioni permissive per la crescita, mentre il termine “tollerante” descrive le condizioni in cui il microrganismo sopravvive, ma non necessariamente cresce. Ad esempio, un “batterio termofilo” cresce in presenza di elevate temperature, mentre un “batterio termo-tollerante” sopravvive ad elevate temperature,ma cresce a temperature inferiori.

Fattori influenzanti la crescita

  • Temperatura:La maggior parte dei batteri cresce in un intervallo termico di circa 20°C, esibendo la massima velocità di crescita ad un certo “optimum termico”
    Psicrofili: ~0 – 20ºC
    Mesofili: ~10 – 50ºC
    Termofili: ~40 – 75 ºC
    Ipertermofili: ~70 – 110 ºC
  • pH:
    Acidofili: crescono al di sotto di pH 6 (pH 2 – 6, generalmente), ne fanno parte funghi e lieviti (pH 5 – 6) ;
    Neutrofili:crescono tra pH 6 – 8, sono maggior parte dei batteri;
    Alcalofili:crescono a pH > 8 (pH 8 – 9.5, generalmente);
  • Concentrazione salina (pressione osmotica):
    Alofili:Crescono ad elevate concentrazioni saline(generalmente ≥1 M), con elevate pressioni osmotiche, Stafilococchi;
  • Ossigeno:
    Aerobi obbligati: vivono solo in presenza di O2;
    Aerobi –anaerobi facoltativi: vivono in presenza/assenza di O2;
    Anaerobi obbligati: vivono in assenza di O2;
    Microaerofili: vivono in presenza di (O2 5%, CO2 10%, N2 85%);

Quando un microrganismo si istaura in un nuovo ambiente, il suo modo di moltiplicarsi non è costante dipende dalle caratteristiche dell’ambiente, della temperatura ma anche dal tipo di microrganismo. Il modo in cui un microrganismo si può moltiplicare si divide in 4 fasi:

crescita dei microrganismi nei terreni di coltura

  1. Fase di latenza: è il periodo che impiegato dal microrganismo per adattarsi all’ambiente.
  2. Fase crescita esponenziale: si tratta del momento in cui il microrganismo si moltiplica velocemente, sfruttando al massimo le risorse dell’ambiente.
  3. Fase stazionaria: è la fase in cui metà dei microrganismi cresce e si duplica, invece l’altra metà muore. Di conseguenza il numero totale dei microrganismi rimane costante.
  4. Fase di declino: è quella fase in cui i microrganismi scarseggiano, di conseguenza il numero di cellule che muoiono sono di più rispetto a quelle che riescono a duplicarsi.

Fonte dell’articolo: Principi di microbiologia medica, La Placa – Esculapio;

Immagine in copertina: Haemophilus Influenzae in coltura Agar Sangue ( tratto da http://it.wikipedia.org/wiki/File:Haemophilus_influenzae_01.jpg)

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Diplomatosi presso il Liceo Scientifico "O. Tedone" di Ruvo di Puglia(Ba) è attualmente iscritto al quarto anno del C.d.L. in Medicina e Chirurgia presso l'Università degli Studi di Chieti e Pescara "G. d'Annunzio". Appassionato di nuove tecnologie, programmazione e comunicazione si occupa della gestione tecnica della piattaforma MedMedicine. Social: Facebook, Twitter, Google+